PRUEBA DE HIBRIDACIÓN O SECUENCIACIÓN EN LA HIPERTENSIÓN ARTERIAL

PRUEBA DE HIBRIDACIÓN O SECUENCIACIÓN EN LA HIPERTENSIÓN ARTERIAL 

HIBRIDACION POR SONDAS

Las sondas (probes) son segmentos de ADN o ARN que han sido marcados con enzimas, sustratos antigénicos, quimioluminiscencia o radioisópotos, los que se pueden unir con una alta especificidad a una secuencia complementaria de ácido nucleico. Estas sondas pueden ser dirigidas a un segmento de ADN o ARN seleccionado, que puede tener de veinte a miles de bases de largo. Las sondas de menos de 50 pares de bases son denominadas oligonucleótidos y pueden ser sintetizadas y purificadas con relativa facilidad por instrumentos comerciales actualmente disponibles. Las sondas de oligonucleótidos tienen la ventaja de hibridar más rápidamente a las moléculas blanco (target) y pueden, bajo ciertas condiciones, detectar el cambio de un nucleótido dentro de una secuencia de ácido nucleico.

Hibridación y enzimoinmunoanálisis para HTA.

Se tomaron 20 µl de reactivo de desnaturalización (solución 3 del kit) y se colocaron en una placa, se agregaron 5 µl del producto de amplificación y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. Posteriormente se agregaron 225 µl de buffer de hibridación (solución 4 del kit) y se mezcló (todo este proceso se realizó para cada muestra). Se transfirieron 100 µl de la mezcla para una placa suministrada por el kit, se cubrió a fin de prevenir la evaporación y se incubó durante 2 h a 37 °C mientras se agitaba a 300 rpm.

Una vez realizada la incubación, se retiró la solución completamente y se lavó con 250 µl de solución buffer (solución 5 del kit) durante 30 s cada una y se retiró el buffer cuidadosamente. Con posterioridad se añadieron 100 µl de anti-DIG-POD (solución 11 del kit), se cubrió la placa y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min mientras se agitaba a 300 rpm. Se retiró la solución completamente, se lavó nuevamente con buffer 5 veces, se retiró el buffer y se agregaron 100 µl de solución TMB (solución 8 del kit), se cubrió la placa y se dejó a temperatura ambiente durante 20 min mientras se agitaba a 300 rpm. Sin retirar el sustrato, se agregaron 100 µl de reactivo con el fin de detener la reacción (solución 9 del kit). Posteriormente con un lector de enzimoinmunoanálisis se midió la absorbancia de las muestras a 450 nm con un valor de referencia de 690 nm dentro de los 30 min después de haber detenido la reacción (A450nm-A690nm).

BIBLIOGRAFÍA: 
Actividad de la telomerasa en leucocitos de sangre periférica de pacientes con hipertensión arterial esencial